质粒质量高DNA它是细胞和基因治疗生产的关键组成部分，因此需求量很大。因此，有必要优化生产，以满足治疗药物生产的数量和质量要求。DNA（pDNA）由于尺寸大、切割敏感性高、粘度高、pDNA与生产过程中杂质的相似性面临着一些挑战。因此，了解过程的各个方面对大规模成功生产尤为重要。随着高需求和高质量的要求，搜索可以澄清pDNA专家在优化机会、回答相关生产问题方面非常重要。在这一点上。“询问专家”在会议上，我们聚集了一个专家小组来回答相关细胞和基因治疗应用中的质粒DNA制造问题。

EMEA细胞和基因治疗分部开发副主任NargisseEl-Hajjami博士

NargisseElHajjami博士是一名拥有10年科研、工艺开发和生物生产工程经验的分子微生物学家和生物技术专家。她目前的职责是通过领导战略计划，支持市场战略和客户建立，开发和优化其知识和生产过程，并致力于扩大细胞和基因治疗市场。

过程开发科学家LaurensVergauwen

Laurens毕业于比利时鲁汶大学，获利工业化工硕士学位。他是下游处理专家，支持客户开发和优化各种下游净化技术(色谱，TFF，澄清、无菌和病毒过滤)。由于能够与不同类型的制造商合作，他对包含质粒的质粒进行了合作DNA各种生物医学的净化策略都有很强的了解。

问题1是否有任何关键的培养液成分能提高生产力？

有几个参数会影响细菌的生产力，如主细胞库的选择、生长率、培养液、进料速度、适当的生长条件和参数，如pH，渗透压，光密度（DO）和温度。

一般介质成分包括碳源、氮源、硫酸镁、磷酸二钾、磷酸一钾和矿物质。培养液可以用最小和半定义。使用最少的培养液可以获得高度可重复的批号。另一方面，由于复合成分（如酵母提取物）提供生长因子、氨基酸、嘌呤和嘧啶，半限制培养液可以支持更高的细胞密度。葡萄糖作为碳源，是一种传统的使用方式，因为它具有高效的新陈代谢和廉价的价格。然而，葡萄糖可能会导致醋酸盐的过度生产（克拉布效应）。这可以通过用葡萄糖代替甘油来避免。甘油也有助于降低率。

氮通常由酵母提取物、氨基酸或蛋白质等复杂成分提供。添加硫酸镁和磷酸钾提供镁、硫、钾和磷源（磷酸盐也起缓冲作用）。其他少量矿物含有介质的复杂成分，或可通过少量矿物溶液添加。C:N对质粒产量的比较有很大的影响。建议从2:1到8:1等不同例。每种介质类型的最佳比例不同。

问题2我的质粒DNA不稳定，我们想尝试提高稳定性，对你有什么好的建议？

一方面，有效优化您感兴趣的基因（插入）和质粒（载体）序列是很重要的。然而，有些质粒本身是不稳定的。例如，如果插入特别大的和/或反向串联重复。对于大基因，应选择小载体。然而，如果这种情况已经存在，很可能需要低**数量产生质粒(反向串联重复时也是如此)。

另一方面，调整生长条件（如低温生长），选择替代宿主，优化工艺条件，选择合适的缓冲液进行处理、准备和储存pDNA，它还可以帮助提高其稳定性。DNA酶污染和pH值对pDNA稳定性有很大影响。DNA酶能降解消化DNA双链，极端pH可以破坏、变性甚至改变pDNA序列。所以，为你的pDNA选择合适的缓冲液和溶液是长期保持产品稳定性的基础。最好的选择之一是选择合适的缓冲液和溶液。Tris缓冲液与EDTA，由于Tris允许控制缓冲液pH值以平稳pDNA，而EDTA螯合物抑制DNAse活性。pDNA一般存储在-20°C至-80°它可以稳定多年，也可以稳定在4年°或者在室温下，但时间很短。

问题3为何GMP质粒如此昂贵而供不应求？

GMP一般来说，生产是一个成本较高的过程。原因很多。GMP生产过程中使用的原材料纯度更高，价格更高。需要一个特殊的生产区域（如净化室）。清洁方法需要验证，最终的GMP商品的纯度很高，这已经通过一系列经验证明的分析方法得到证实。供不应求的原因是，除了疫苗和癌症治疗的应用外，全球细胞和基因治疗市场也大幅增长。据报道，近两年来，实验药物总数大幅增加，各种药物正在获得商业分销许可证。由于这种增长，提供GMP合同制造商正试图跟上日益增长的需求。最近的流行加剧了这个问题，因为许多替代疫苗正在开发中，包括DNA疫苗和mRNA疫苗，包括质粒DNA是mRNA体外转录过程的起始材料。

问题4如何为我的基因选择最好的质粒？

主要有两种载体，复制载体和表达载体。复制载体产生大量基因。**理想的选择。如果目的是表达感兴趣的基因，则需要表达载体。复制载体的关键是复制载体。**数（取决于ori），可选择标记和克隆位点。一般来说，高位是首选。**数字。请注意，当基因对细胞有毒或质粒不稳定时，**数字可能是有益的。选择标记允许识别阳性转换器。在大多数情况下，这些标记将是耐药标记，但也应用于缺乏营养标记。检查载体是否包含适合插入的克隆位点很重要。到目前为止，大多数载体都含有多个克隆位点，这使得载体很可能与所选的限制性内切酶兼容。

表达载体包括一些与表达相关的附加顺序，如启动子、核糖体结合点、终止子、标签或融合蛋白。其中一些是针对宿主的。因此，表达载体需要与所选宿主生物（如哺乳动物、昆虫等）兼容。

我们可以看到问题5DNA产量很低，你有好的计划吗？

为了有一个好的质粒DNA（pDNA）产量，最好的方案是有一个稳定的整体过程，每一步都有效优化。因为因为。pDNA大尺寸、高负电、高粘度和污染物pDNA相似特征(开环pDNA，基因组DNA，高含量RNA），pDNA纯化具有挑战性。此外，大质粒对剪应力敏感，进一步使纯化复杂化。为了高收率纯化超螺旋。pDNA（治疗/转染的理想方法）需要良好的优化下游技术。为下游技术的每一步提供解决方案和能力，以确保最佳pDNA产量和纯度。以下是各下游机组运行的注意事项。

细胞收获

使用离心或微滤来获取细胞TFF。需要处理批量体积(1000L）离心一般更具成本效益。大规模离心产生的高剪切力在使用离心时需要特别注意。开放通道可用于微滤，平板可用于微滤TFF如果包含设备Durapore的ProstakTM卡式过滤器®0.1或0.2μm微滤膜或Pellicon®硬脂孔盒式磁带®V屏或Bio**x®1000kDV筛超滤膜。开放式进料通道为细胞保留创造了一条温和的流动路径，导致切割量低，可用于处理粘度和/或高固态进料。使用这种膜截止阀时，使用双泵(渗透控制)TFF系统很重要。TFF获取步骤通常包含体积浓度的2-5倍，然后重新过滤体积的3-5倍，以便在进一步下游纯化之前，清除废培养基成分和细胞外杂质。TFF通常获得低跨膜压（TMP；3–5psi）和ΔP（12.5时，pDNA如果会出现不可逆转的变性，pH基因组太低DNA不会完全变性，并可能使下游净化过程更加复杂。标准碱裂解的成型时间相当短，通常在5分钟内完成。

碱解后，pH值被中和。这通常通过添加高盐缓冲液来实现，例如0浓度.7M–3.0M，pH值为5–7.醋酸钠或醋酸钾，洗涤剂(0).2-1%十二烷基硫酸钠)存在时，添加/不添加1.0–1.5%氯化钙(促进RNA聚乙二醇（PEG）中和缓冲液中还可以添加聚乙烯亚胺，以促进基因组DNA沉淀。中和沉淀过程中的对称混合对维持pDNA质量尤为重要。

净化

pDNA工艺澄清设备的操作应能去除进料流中的固体含量。可以通过离心和/或正常流量过滤来澄清。传统的澄清方法是离心法。使用离心法时，应注意剪应力，这可能会破坏超螺旋质粒的结构，降低产量。离心也可能需要两个澄清步骤。使用传统流量过滤器来澄清是一种现代方法。当使用这种方法时，可以使用未经处理、预处理或预澄清的进料流。预处理对澄清和过滤能力有很大影响。在考虑过程的可扩展性时，必须仔细选择。预处理方案包括重力沉降和分离，Polygard®铬1µm/Polygard企业®铬50µm，不锈钢网过滤器、纸过滤器、离心分离。Polygard的容量®CR过滤器通常为0.55–在8升/英尺的范围内。

推荐的过滤器设置如下：

过滤器的预期容量在一定程度上取决于是否进行预处理：

使用Clarisolve®米利斯塔克和米利斯塔克®过滤器>90%。使用含盐缓冲液可以提高回收率。使用含盐缓冲液。MilliporeExpress®的SHC灭菌级过滤器澄清后一般在400-650L/m2之间。

切向流过滤（TFF）

澄清后，可以选择TFF步骤。这将允许浓度和渗滤器将介质交换到适合下游色谱步骤的缓冲液中。色谱加载时间可以通过在色谱前浓缩来缩短。RNA，小分子基因组DNA和小分子蛋白TFF在此过程中可以去除，这也有助于避免色谱树脂的污染。

执行TFF一些关键注意事项包括：

•为了避免质粒损伤，需要仔细调整工艺参数。

•造成产量损失的膜污染。

•高盐缓冲液促进质粒压缩，这可能会导致产量损失。

这些问题可以通过仔细挑选推荐的开放通道膜来解决，比如Pellicon®2Ultracel®或Bio**x®100或300kDaC避免使用屏幕。根据明渠的使用，可以降低剪应力。此外，通过适当的薄膜尺寸来最大限度地减少处理时间也很重要。当使用这些宽膜截止阀时，根据使用双泵（渗透控制）TFF控制渗透通量的系统非常重要。这将有助于避免膜污染。

典型的TFF工艺参数为：

色谱纯化

阴离子交换色谱一般用于色谱纯化（AEC）与疏水相互作用色谱（HIC）。这两种技术都用于捕获或中间纯化/抛光，并且经常结合使用。当使用时。AEX作为pDNA使用捕获步骤NaCl（120-250mm）加标澄清的裂解物是有益的。这将被清除。RNA影响，然后提升pDNA融合能力。需要提前确定补充剂的最佳盐浓度，例如在测量增加氯化钠浓度时的质粒结合能力时，通过少量滴定板的批量分析。对于不同类型的树脂/膜吸附剂，可以这样做。

推荐用于质粒净化的树脂及其各自的性能：

由于质粒的大尺寸，在市场树脂上观察到典型的低结合能力。这主要是因为AEX培养液最初是为蛋白质纯化而设计的，因为质粒分子比蛋白质大得多，不能进入小孔，导致结合能力低，传质慢。Fractogel®和Eshmuno®树脂包括触手技术，通常比其他可用树脂具有更高的结合能力。Natrix®Q基于膜技术，包括大对流孔。后者促进传质，提高组合能力(5-10mg/mL）。因为膜技术，需要很短的停留时间