质粒是一种独立于染色体之外，能够进行自主复制的细胞质遗传因子，相对分子量一般在106-107范围内，广泛存在于真核和原核细胞中，是目前基因治疗领域及疫苗制备中最重要的工具之一。

主要应用形式有：直接体内注射，如DNA疫苗和裸质粒基因载体；在体外转染改造靶细胞，再回输体内，如T细胞；在体外多质粒共转染细胞，生产病毒载体，继而用于体内或体外基因治疗，如腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）；作为转录模板，如mRNA疫苗/药物。

无论裸质粒还是包装病毒载体，最终都是将质粒所携带的目的基因导入靶细胞并表达，进而达到治疗或预防疾病的目的。

高质量、高纯度的超螺旋DNA质粒是确保裸质粒、AAV、LV等基因载体安全性、有效性的前提条件，而质粒的大规模生产需要依靠高产的宿主菌、稳健的质粒表达载体及高效的生产工艺，本文将详细介绍楷拓生物规模化质粒制备工艺。

质粒载体与宿主细胞的选择与优化

无论是从科学还是经济角度出发，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键。目前应用于治疗用的质粒DNA载体，通常选用ColE1型质粒或其衍生的质粒载体。ColE1型质粒具有分子量小、拷贝数高的特点，ColE1型质粒只需要宿主染色体复制起始蛋白即可开始复制。通过质粒工程，能够在构建生产质粒过程中，增强质粒的产量与超螺旋比例。

在质粒DNA的生产过程中，质粒DNA的序列完整性对产品的安全性、产量和质量的影响巨大。在实际生产中，通常使用的宿主菌为endA基因突变的endA1菌株，例如DH5α、JM109等endA基因突变后，大肠杆菌失去了合成具有功能活性的核酸内切酶Ⅰ的能力，从而提高质粒DNA在发酵过程中的稳定性。宿主菌本身的代谢优化，同样能够高效提高质粒DNA的产量。

发酵策略的优化

现阶段质粒DNA的生产大部分采用大肠杆菌为宿主菌进行生产。作为医疗目的的质粒，在实际生产中，不仅会要求质粒的稳定性，同样会要求较高的比生产率。通常情况下，质粒DNA的生产会采用高密度培养技术，这样能减少培养体积，缩短生产周期。

大肠杆菌高密度培养使用的培养基一般为半合成培养基。培养基中各组分的浓度比例要恰当，尤其为碳氮源的比例。其中碳氮源比例过大、菌体繁殖数量少、细菌代谢不平衡，不利于产物的积累，碳氮源比例过小、菌体生产旺盛，将导致菌体提前自溶，碳氮源比例合适、但前期浓度过高，将导致前期菌体大量生长，积累大量的代谢废物，发酵液粘度增大，影响后期产物的合成，碳氮源比例合适但前期浓度过低，将影响菌体的繁殖，延长培养时间。

分批补料为高密度发酵过程中最常用的补料策略，其补料方式主要分为反馈补料和非反馈补料。非反馈补料通常有恒速补料、变速补料和指数补料三种方式，恒速补料为预先设定好恒定的营养流加速率，细菌的比生长速率逐渐下降，菌体的密度呈线性增加，变速补料为在培养过程中流加速率按照设定的阶梯不断增加，细菌的比生长速率在不断改变，指数补料将生长速率设为恒定值，流加速率呈指数流加，菌体的密度也呈指数增加。反馈补料按照反馈指标的不同，分为恒pH值法、恒DO法、菌体浓度反馈法、CER法及DO-stat法。分别为通过pH的变化，推测细菌的生长状态，调节流加碳源的速率，调节pH为恒定值；根据溶解氧的变化曲线，调整碳源的流加速率；通过检测菌体的浓度，评估营养的利用情况，调整营养物质的流加速率；通过检测二氧化碳的释放率，评估碳源的利用情况，调整营养物质的流加；通过将DO与搅拌、补料速率藕联，维持恒定的溶解氧。

宿主菌的生长条件、溶解氧及温度等都能改变质粒的产量与超螺旋质粒的比例。溶解氧不足或二氧化碳过剩将导致乙酸形成，导致宿主菌的衰老和死亡，降低质粒DNA的质量和产量，此外，添加氯霉素、采用氨基酸饥饿法及添加痕量微量元素等都能够提高质粒DNA的产量。

在重组菌生长的过程中，重组质粒DNA往往会丢失，这种情况的发生主要分为分离不稳定和结构不稳定两种。分离不稳定主要原因有两个，首先，外源基因的不断复制对宿主产生代谢负担，导致带有重组质粒的宿主生长速率降低，丢失质粒的细胞具有生长优势，在培养中比例不断增大；其次，质粒上的基因表达占用了宿主物质、能量，干扰了宿主的正常代谢，从而诱导宿主产生相应的应激反应，造成质粒不稳定状态。质粒的拷贝数影响质粒的分离稳定性，通常高拷贝质粒稳定性要高于低拷贝质粒，与质粒的复制分配方式有关。

结构不稳定的主要由基因突变造成，通常大的质粒在发酵过程中，受环境中各种因素的影响而出现变异的几率较高，同时有研究也表明，质粒中rDNA片段的序列也会影响质粒在细胞中的稳定性。

下游工艺路径的选择与优化

质粒是一段麻花样的环状超螺旋 DNA，是常见的分子生物学工具。抽提质粒几乎是每个生物人的必备技能之一。抽提试剂盒产量低，最多只能提供微克至数毫克级的质粒，足以满足科研需求，但产品质量不稳定，纯度和杂质无法达到药用标准，特别是质量超螺旋比例和内毒素。内毒素无法达到标准，而质粒中的内毒素是转染的大敌，内毒素会导致转染效率显著下降，特别是对内毒素敏感的细胞，例如原代细胞、悬浮细胞、造血细胞等。同时质粒抽提试剂盒含有动物源性的RNA酶，不符合法规要求。

如果需要大规模制备病毒载体，试剂盒的质粒产量远远无法达到。此外，包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒，每个质粒大小、序列都不一样，上游表达量也有区别，甚至稳定性都有差异。因此需要采用层析工艺获得一定规模的高纯度超螺旋质粒，层析过程中可以去除产品相关杂质，如开环DNA、质粒DNA聚集体（dimer、trimer、tetramer，etc.）,工艺相关杂质，HCP、HCD、HCR等，控制微生物负荷，如细菌内毒素、微生物限度等。同时纯化工艺具有稳健的工艺流程、可进行不同规模的放大，具有相关法规文件支持。

楷拓生物专注于质粒规模化生产工艺开发。其中，武汉基地质粒发酵规模5-100L，可生产100mg-6g质粒；苏州基地质粒发酵规模20-500L，可生产3-30g质粒。

收菌  常规收集菌体方式为离心收集，但是离心收集存在放大困难的问题。楷拓生物质粒CDMO平台采用中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量（大肠杆菌发酵液）、高粘度（菌体裂解液）和剪切力敏感型样品（质粒），并且具有良好的线性放大能力。在这一步推荐使用 750KD 、 0.1μm或0.2μm 的 1 mm 内径的中空纤维进行菌体的收集和清洗。

裂解  菌体裂解方法有很多，常用的是碱裂解①。裂解的作用主要为释放目的质粒同时去除HCD，是整个下游工艺回收率和HCD控制的基础和关键。碱裂解的难点主要为裂解效率、HCD去除、工艺稳定及放大可行性。楷拓生物具有成熟的碱裂接平台，自主设计了连续裂解装置。通过优化稀释倍数、裂解时间、中和时间等关键参数，连续裂解工艺的裂解效率稳定在90%以上，HCD在粗纯后可以控制在0.5%的水平。

裂解液浓缩  当溶液 I、II 和 III 相继加完后，裂解液体积会变得非常大，在层析纯化前进行浓缩和洗滤，不仅可以大大减小样品体积，还可以有效去除 RNA、色素和部分 HCP、HCD 等杂质，减少层析阶段的负荷。在质粒的超滤浓缩过程中，需要确定中控纤维的膜孔径，考察剪切力和浓缩时长及浓缩倍数的影响，避免质粒的超螺旋构象被破坏。

层析工艺  楷拓生物具有市面上经典三步层析工艺平台，同时也兼具两步层析工艺，也可以根据客户需求进行特定层析工艺开发。三步层析工艺具有通用性强、无需添加絮凝剂、针对不同大小的质粒稳健性强的特点，其中三步层析为凝胶层析、亲和层析和离子交换层析。

首先，使用Sepharose 6 Fast Flow在1.5M或更多硫酸铵的存在下，以基团分离模式将存在于澄清细胞裂解液中的pDNA与RNA分离如上图所示，DNA和RNA达到基线分离。RNA在凝胶层析过程中基本被去除。与典型的SEC相比，柱可以装载超过30%的柱体积，并且在没有显著稀释的情况下，产率始终高于90%。此外，线性流速可高达80cm/h，柱高低至25cm。

随后的亲和层析步骤中通常使用嗜硫亲和填料，通过质粒分子与配体的选择性相互作用，以达到分离超螺旋质粒和开环质粒的目的。在高浓度的离液盐存在下如2M硫酸铵，SC pDNA可以保留在层析柱上，但不能结合OC pDNA。可以通过降低缓冲液中的硫酸铵浓度或在含有硫酸铵的缓冲液中进行梯度至2M NaCl来洗脱SC pDNA。

该过程的最后一步是使用离子交换层析浓缩和精纯样品，经过前两步层析，质粒的纯度和均一性（超螺旋比例）达到了新高度，最后一步层析重点是去除内毒素。质粒带有高密度的负电荷，可以在高盐浓度下与强阴离子交换填料结合。将亲和层析的洗脱液进行稀释，可以上样至阴离子交换层析填料，而内毒素在此高盐情况下不与填料结合，从而实现去内毒的功能。经过此步，内毒素含量可降至＜1 EU/mg。

超滤换液同裂解液的超滤浓缩一样，推荐试用适当大小的膜包或中空纤维进行超滤，在低剪切力作用下进行更好的保护质粒的超螺旋构象。

结语：每个质粒开发的方法各不相同，不同的大小、不同的载体、不同的片段在工艺上的体现也是截然不同的。面对不同的需求，楷拓生物质粒平台可以针对每个质粒的用途和特殊性去开发专属性的工艺，提供高效、灵活、可定制的专业服务。

参考文献：

①Birnboim HC, Doly J. Nucleic Acids Res 1979;7(6):1513–23.